细胞因子和水钠通道蛋白在急性肾损伤致肺损伤中的作用(2)

^［2］。左侧肺行支气管肺泡灌洗，每次用3 ml的磷酸盐缓冲液（PBS）灌洗左肺，共3次，合并3次收集到的支气管肺泡灌洗液（BALF） 冻存待测细胞因子。用考马斯亮蓝法测定BALF中蛋白质量浓度。右肺中叶-80 ℃保存待测AQP₁及α-ENaC。
1.2.3 HE染色 肺组织常规固定、脱水、包埋、切片后制作HE切片，每张HE染色切片随机选取多个高倍镜视野，观察并比较肺组织细胞的改变。
1.2.4 IL-6与TNF-α的检测 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA） 检测血清及BALF中的TNF-α和IL-6的质量浓度。检测步骤按照试剂盒说明书操作。
1.2.5 AQP₁检测 开胸取出右肺中叶，迅速液氮冻存，制备匀浆，然后采用ELISA检测肺脏AQP₁的质量浓度。检测步骤按照试剂盒说明书操作。
1.2.6 Western blot检测α-ENaC 开胸取出右肺中叶，迅速液氮冻存，制备匀浆，提取蛋白，测定蛋白质量浓度后，然后保存于-80 ℃待用。取100 μg 的蛋白样品于12%的SDS-PAGE 凝胶中进行电泳，待目的蛋白接近凝胶底部时停止电泳，4 ℃、120 V恒压电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。分别加入1∶1000稀释的α-ENaC一抗和1∶500 稀释的GAPDH （内参）一抗，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1000）室温孵育1 h后发光显色，凝胶成像系统照相，实验结果采用quantity one软件分析，扫描吸光度值，以目的蛋白与内参GAPDH的比值表示。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差（x±s）表示。组间比较采用重复测量资料的方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠动脉血气变化
各组大鼠动脉血气的变化趋势见表1。B组在实验后6 h动脉血pH值开始下降，酸中毒明显加重，与A组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。各组动脉血PCO₂有下降趋势，但各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。B组与A组动脉血PO₂在实验后略有下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.2 大鼠肺泡灌洗液中蛋白水平、W/D值变化
A组在实验后肺泡灌洗液中蛋白水平、肺W/D值无明显变化。B组在实验后2 h肺泡灌洗液中蛋白水平、肺W/D开始增加，与A组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。
2.3 肺组织结构的改变
A组在实验后8 h大鼠肺泡结构完整，肺泡内无明显渗出，无肺间质水肿表现。B组在实验后8 h肺泡上皮肿胀，肺泡壁增宽、毛细血管扩张和充血，肺泡间质，肺泡内可见炎症细胞、红细胞和蛋白渗出，部分视野可见小呼吸道损伤，肺泡结构紊乱，表现出急性肺损伤的病理改变。如图1。 　2.4 血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6的质量浓度
B组大鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6的质量浓度，在实验后2 h开始增加，与A组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3。
2.5 肺组织中水通道蛋白的质量浓度变化
B组大鼠肺组织中AQP₁质量浓度，在实验后2 h开始逐渐减少，与A组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表4。
2.6 肺组织中上皮钠通道蛋白（α-ENaC）的表达
两组大鼠肺组织中α-ENaC的Western bolt结果见图2。B组大鼠肺组织中α-ENaC质量浓度，在实验后2 h开始逐渐减少，与A组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
有研究显示重症监护室（ICU）有5%～6%的患者发生急性肾损伤并且需要肾替代治疗^［3］。虽然透析技术及高级治疗方法的不断改进，但急性肾损伤的病死率仍居高不下。急性肾损伤的高病死率与其致远隔器官的损伤密不可分^［4-6］。由于肺庞大的血管网系统，因此是最易受损的器官。有研究显示，ICU中，AKI常常合并ALI，尤其是ARDS，这类患者的病死率接近80%^［7］。在急性肾衰竭患者末期由于钠水潴留、容量负荷过重，引起的肺充血、肺水肿、胸腔积液的发生，X线检查可出现“蝴蝶翼”征^［8］。但是关于急性肾损伤早期肺脏在病理与病理生理究竟是如何改变的研究目前较少。
在本研究中发现大鼠双侧肾动静脉夹闭2 h后大鼠动脉血pH值逐渐下降，酸中毒越来越重。这可能是由于肾的有机酸及代谢废物排出障碍所引起。但大鼠动脉血氧分压与健康对照组并没有发生明显改变，这表明在急性肾损伤的早期并没有引起肺的通气-换气功能障碍；也可能是由于本实验的观察时间较短，并没有观察到肺通气-换气障碍的发生。与以往的研究相似急性肾损伤组在肾损伤后2 h肺泡灌洗液中蛋白水平均明显增加，肺W/D下降^［9-13］。通过肺组织HE染色可以看到急性肾损伤组肺泡上皮肿胀，肺泡壁增宽、毛细血管扩张和充血，肺泡间质水肿明显，肺泡内炎症细胞、红细胞和蛋白渗出明显增多，大量炎性细胞浸润，部分视野可见小呼吸道损伤，肺泡结构紊乱，表现出急性肺损伤的病理改变。这表明在急性肾损伤早期虽然肺的氧合功能没有受到影响，但是肺泡上皮-内皮屏障功能已经受到了影响，肺泡内皮细胞通透性增加，肺上皮细胞液体清除下降，急性肺损伤已经发生。
临床研究发现，ALI/ARDS患者血清和肺泡支气管灌洗液中的TNF-α、IL-6水平增高，且与多器官功能衰竭的发病机制密切相关^［14］。在本研究中发现，急性肾损伤后大鼠血清中及肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-6 含量均明显增加。这说明在急性肾损伤早期激活了体内炎症反应，体内细胞因子增加，引起了急性肺损伤的发生。分析其原因可能是由于急性肾损伤后体内各种有毒代谢产物的蓄积及手术创伤等激活了全身炎症反应，并且炎症介质通过肾脏的排泄、灭活减少，从而使大鼠血液循环中TNF-α、IL-6 含量明显增加。由于肺庞大的血管系统，血液循环中的大量的炎症介质在肺内蓄积，致使TNF-α、IL-6在肺内的水平增加，引起了急性肺损伤的发生。
本研究发现，在急性肾损伤后大鼠的肺内表达AQP₁及α-ENaC均有明显的下降。这说明在急性肾损伤的早期，肺表达AQP₁及α-ENaC的水平已经开始下降，这可能是急性肾损伤早期引起肺损伤的原因之一。研究表明肺损伤的主要病理变化之一是肺水肿，在肺组织肺泡内水的转运主要有两条途径。一是经AQP的被动转运，取决于肺泡内压力和肺毛细血管压力差以及肺泡内液体与血浆的渗透梯度和水通道蛋白的数量。二是伴随钠的主动转运，肺泡上皮钠水主动转运系统由ENaC、Na(责任编辑：论文发表网)转贴于八度论文发表网: http://www.8dulw.com(论文网__代写代发论文_论文发表_毕业论文_免费论文范文网_论文格式_广东论文网_广州论文网)