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流式细胞分选术的应用进展

作者:黄莹莹更新时间:2013-05-03 16:16 点击:次

【论文发表关健词】流式细胞；分选；应用

【职称论文摘要】

流式细胞分选技术具有检测速度快、统计学精度高、可在分析的同时把具有指定特征的细胞分选出来等特点，因而应用广泛。本文简要概述了流式细胞术的概念及流式细胞分选的原理，并对其在肿瘤干细胞分选、外周血细胞分选、染色体分离、稳定细胞转染株筛选等方面的应用进展作一综述。

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是一项新型的、发展迅速的生物医学分析技术，它不仅可以对细胞、微生物等进行检测分析，而且还可以根据颗粒特性进行分选，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大等特点，因而被广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学、血液学、药物开发、环境检测、食品卫生防疫等科学研究和工作中[1]。
　　1 流式细胞术的概念
　　流式细胞术是20世纪60年代末开始发展起来的技术，它是集激光技术、光电测量技术、电子生物技术、电子计算机技术、流体力学以及荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。流式细胞仪是应用流式细胞术的有效工具，它使细胞或微粒在鞘液包裹下流动，逐个通过激光聚焦区，并用高灵敏度的光学系统收集各散射光及荧光信号，再经过计算机系统对采集的信号进行存储、显示，从而得以对粒子进行多参数分析，包括诸如粒子颗粒度和大小、细胞周期、细胞内细胞因子、细菌表面抗原、多分子复合体排列、多价反应动力学等[2]。分选型流式细胞仪一般还有筛分的作用，可以根据所检测颗粒的某种性质进行分选和回收，用于后续功能实验。并且，如果整个分选的过程是在无菌条件下进行的，分选下来的细胞还可以用来继续培养。在我国，20世纪90年代初已开始研发应用流式无菌分选的技术[3]。
　　2 流式细胞分选的原理
　　分选型流式细胞仪一般由液流系统、光路系统、检测分析系统和分选系统4部分组成。流式的分选功能是通过鞘液流形成含有细胞的带电液滴而实现的。在流动室的喷嘴上装有一个高速振荡器，该装置在充电后以每秒几万次的振动频率，使鞘液流成为上万个液滴；目前，先进的分选型流式细胞仪震荡速度可以达到10万/s。此时，细胞的荧光和散射光信号已被测量（即判断液滴是否该被分选），这时给鞘液流一个充电脉冲信号，待分选的液滴就全部带上了电荷。流式细胞分选仪的检测分析系统通过分选设门特性迅速判定其是否为靶细胞。当充以不同电荷的含细胞的鞘液滴流经带有正负几千伏恒定静电电场的偏转板时，就根据自身所带的电荷性质产生偏转而落入各自的收集管中，不带电荷的液滴就进入废液槽中，从而实现了细胞的流式分选[4]。
　　现代高端型流式细胞分选仪每秒可以实时检测定量分析、分选数万个细胞，仪器可选配3-9根激光管，最多可检测l8个荧光参数，从而满足日益多元化的、深入的前沿科学研究的需要[1]。
　　3 流式细胞分选术的应用
　　3.1 利用流式细胞分选术分选肿瘤干细胞
　　肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新、无限增殖及多向分化潜能的细胞，这部分细胞虽然只占少部分，但在肿瘤的发生、演进、复发、耐药及逃逸免疫系统的识别和清除过程中可能发挥了至关重要的作用[5]。因此，建立有效的肿瘤干细胞分离方法，将有助于人们深入了解肿瘤的发病机理，从而建立新的有效的治疗方法。例如，王玲燕等（2012）[5]采用流式细胞分选术从人乳腺癌细胞系MCF-7中分选CD44+CD24-/low 乳腺癌干细胞，进行了干细胞比例分析，并用免疫荧光法检测、比较分选获得的细胞和对照细胞的干性和分化标记物的表达状态。结果表明分选获得的CD44+CD24-/low乳腺癌于细胞阳性比例达90%以上，即CD44+CD24-/low表面标记物分选的方法可以富集高纯度的乳腺癌干细胞。Yang等[6]通过流式分选从肝癌组织中分离出了CD45-CD90+细胞，研究表明CD45-CD90+可以用来作为人类肝癌的一个标志物，亦能成为诊断和治疗该恶性肿瘤的重要靶点。近期，Hassan等[7]又通过流式分选得到了具有类似肺癌干细胞的细胞群，通过对其功能进行研究，可为肺癌的治疗提供有力的参考依据。
　　3.2 利用流式细胞分选术分选外周血细胞
　　传统的从外周血分离单核细胞的方法一般需要反复离心清洗，会造成大量细胞损失，如需获取纯度较高的单核细胞，则需要进一步利用抗体、磁珠等技术加以纯化，实验成本较高，且获得的单核细胞容易被激活而给实验结果带来影响。基于流式细胞仪的分选功能，根据细胞的大小以及颗粒度等特征，对白细胞直接进行分选获取人外周血中的单核细胞的方法，既避免了多次重复离心，又能分选得到纯度在80%-90% 之间的单核细胞用于后续实验，为深入研究单核细胞提供了良好的技术平台[8]。此外，李璐等应用流式细胞分选仪分离中性粒细胞，阳性细胞收集率和纯度均非常高，试验证实可达99%，且分离时间较短；该方法特别适合含量稀少、比较珍贵细胞的分离[9]。本实验室的流式细胞分选仪曾根据课题组[10]的研究需要，从脾脏或胸腺中分选目的T细胞细胞亚群，分选纯度达98%以上，分选活性好，为后续工作的开展提供了高纯度高质量的细胞。
　　3.3 利用流式细胞分选术分选染色体
　　由于基因组太大或重复DNA和多倍体的存在造成的序列冗余，许多植物物种的基因组分析经常比较困难。Vrána 等[11]通过流式分选的方法得到了高质量的单个染色体，该方法可同时纯化大量染色体，为后续试验，如植物基因组测序等提供了方便。
　　3.4 利用流式细胞分选术分选造血干细胞
　　造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）为血液系统最原始的细胞，具有自我更新、自我维持并向多系分化与增殖的能力，在整个造血细胞群体中仅占很小比例，一直是成体干细胞研究中的热点。徐勇等[12]联合应用免疫磁珠分离和流式细胞分选术，可以较高的回收率快速纯化高纯度的早期造血干细胞亚群。李乔等[13]通过配制HSCs体外培养液并结合流式细胞分选技术，建立了一种在体外不需要基质细胞支持的，稳定的，高通量培养单个HSC形成一个血细胞集落的实验方法。

　3.5 利用流式细胞分选术分选神经细胞
　　在体模型中星形胶质细胞和神经元这些组织结合非常紧密，过去由于研究技术的局限，分开它们的方法很困难，因此研究分离神经细胞的方法即成为近年来国内外相关研究的热点。如王萍等[14]通过反复实践摸索建立了一种较为完善的流式细胞仪分选在体模型中神经细胞的技术方法，该分选方法可以同时获得纯度高、数量多的不同种类的神经细胞。
　　3.6 利用流式细胞分选术建立稳定细胞转染株
　　对于用于体内动物模型的稳定转染细胞的获得，陈亚静等[15]研究发现用脂质体转染、有限稀释法获得单克隆细胞株效率较低；而通过体内传代，流式分选并单克隆化，是获得致瘤性好，体内体外较为稳定的稳定转染细胞株的一个可行方案。近期，陈媛等[16]亦利用逆转录病毒将非融合形式的绿色荧光蛋白质GFP和目的基因稳定整合至靶细胞的基因组中，经过流式分选获得GFP阳性细胞，即为稳定表达目的蛋白的细胞株；该方法高效快捷，极大地提高了稳定细胞株的构建效率，同时该稳定细胞株的建立也为未知目的蛋白的功能研究提供了有用的工具。 (责任编辑：论文发表网)转贴于八度论文发表网: http://www.8dulw.com(论文网__代写代发论文_论文发表_毕业论文_免费论文范文网_论文格式_广东论文网_广州论文网)