不同真菌对2种药用石斛种子共生萌发的效应

      兰科植物的种子非常细小，成熟的种子没有胚乳或子叶，仅有未分化的胚，在自然条件下需要依靠特定共生真菌提供营养来促进其萌发和发育 [1-3]。目前，利用兰科植物种子在人工无菌培养基上进行非共生萌发的技术已经非常成熟，使得通过种子大规模繁殖幼苗得以实现，这在一些药用和观赏兰科植物的商业化生产中已得以广泛应用。非共生萌发技术的优点是种子萌发率较高，一般在95%以上^[4]，但幼苗移植到自然环境当中存活率较低，很难与真菌重新建立共生关系而导致后续的生长发育受到严重的抑制^[5-6]。兰科植物种子的共生萌发，是在人工基质中播种种子并接种共生真菌，利用真菌共生来促进种子萌发和获得幼苗。从理论上说，共生萌发不仅能简化幼苗生产过程，大大降低生产成本，更重要的是能显著提高幼苗回归到自然环境中后的存活率和幼苗生长速度^[7]。兰科植物种子共生萌发技术的应用，在珍稀濒危兰科植物的回归、药用兰科植物的仿生态栽培等方面都具有巨大的潜在应用价值。
　　兰科石斛属Dendrobium的很多种类作为传统的药材和保健品在我国利用历史悠久，素有“中华仙草”之美称。西双版纳是我国石斛的主产区之一，有野生石斛43种、1变种^[8]，其中有22种被加工成石斛商品^[9]。齿瓣石斛D. devonianum在业界被叫做“紫草”，制成的成品称作“紫皮枫斗”，市场价值很高。齿瓣石斛是目前人工集约化栽培规模仅次于铁皮石斛的种类，其在西双版纳地区花期为4—5月，附生于林中树干上，其主要海拔分布范围为1 100～1 600 m，和茶叶的最佳种植海拔重叠，在很多茶园茶树上都有自然生长的齿瓣石斛。兜唇石斛D. aphyllum为西双版纳地区一种常见的石斛，花期3—4月，常附生于海拔600～1 000 m的林中树干或岩石上。其茎杆是加工各类药用石斛产品，如石斛粉、石斛酒、石斛饮料等最主要的原料之一。
　　在人工自然或半自然条件下，开展石斛的仿生态栽培，相对于目前开展的人工集约化栽培，省去了昂贵的棚架、苗床、喷灌系统等基础设施的投入和昂贵的日常管理成本，从而可以满足贫困地区当地居民由于经济条件的限制无法承受的高成本和投入。选择药用价值较高的原生石斛种类，利用西双版纳得天独厚的气候优势，开展古茶园、果园等的石斛仿生态栽培，进行粗放管理，降低栽培管理难度和投入，在增加居民收入、减贫致富的同时，减少对野生资源的采集强度，以达到保护的目的，这也是石斛产业长期可持续发展的新途径。通过作者的实际调查发现，种苗来源是决定石斛仿生态栽培成败的关键因素之一，通过获得特定对石斛种子萌发有效的真菌，开展种子的共生萌发生产种苗，是解决目前石斛仿生态栽培瓶颈问题的关键。
　　目前，作者通过原地共生萌发技术（in situ seed baiting technique）从齿瓣石斛和兜唇石斛原生萌发的原球茎中成功分离得到了2种内生真菌，通过前期实验室中在燕麦琼脂培养基（OMA）上的共生萌发实验，证明所获得的2种内生真菌分别是兜唇石斛和齿瓣石斛种子共生萌发的有效真菌^[10]。本研究在此基础上，在人工混合培养基上开展这2种药用石斛种子和不同真菌的共生萌发研究，为实际利用这2种真菌开展齿瓣石斛和兜唇石斛的共生种苗生产提供依据。
　　1 材料
　　本研究于2013年1—3月在中国科学院西双版纳热带植物园进行。兜唇石斛D. aphyllum和齿瓣石斛D.devonianum的种子为2011年4—5月花期人工异交授粉，果实自然成熟后于2012年3月采收，按Seaton和Pritchard的方法经过种子活力检测和干燥后，于-20 ℃保存^[11]。
　　供试的3种真菌菌株分别编号为FDaI7，FCb4，FDd1。FDaI7为通过原地共生萌发技术从兜唇石斛原球茎中分离获得的菌株，分子鉴定为胶膜菌属Tulasnella真菌^[10]；FCb4为通过迁地共生萌发技术从硬叶兰Cymbidium mannii原球茎中分离获得的菌株，分子鉴定为瘤菌根菌属Epulorhiza菌属^[12]。以上2种真菌的样本保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC， http：//www.cgmcc.net/），编号分别为7552，7553。FDd1菌株则是从齿瓣石斛种子原生地萌发形成的原球茎中分离得到的真菌，通过分子测序，其ITS片段序列在美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information， NCBI， http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST比对分析（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），与登录号为AJ313443.1的瘤菌根菌属Epulorhiza真菌最为相似，最大相似程度为95%，E值为0。根据菌株形态及分子鉴定结果判定为瘤菌根菌属真菌。3种菌株都采用PDA试管斜面法保存于4 ℃冰箱中待用^[13]。

      2 方法
　　2.1 人工混合基质配制和种子播种 收集枯枝落叶，自然风干后人工粉碎，松树皮先用水浸泡1月左右。将准备好的树叶、松树皮和椰糠按1∶1∶1加适量水均匀混合，作为2种石斛种子共生萌发的培养基质。滤除基质中多余水分，保持其水分达到饱和状态。将配好的混合基质分别装入144个长、宽、高分别为12，7 ，4.5 cm的透明塑料培养盒中，每盒装入约1/3容积的基质，基质上放置2条长宽为10，1.5 cm，孔径为45 μm的尼龙网布，用于播种。这样既不影响基质中的真菌菌丝穿过尼龙网布侵染石斛种子，又可使种子不掉落于基质中，便于计数和统计萌发率。将装好基质的培养盒盖上盒盖，在高压灭菌锅中于102.9 kPa，121 ℃条件下灭菌20 min，以消除基质中的杂菌，灭菌后的培养盒置于超净工作台于室温下自然冷却待用。
　　2种石斛的种子用1%有效氯离子浓度的次氯酸钠溶液浸泡15 min后，在超净工作台上分别取适量种子和质量浓度为1 g·L^-1的无菌琼脂溶液在锥形瓶中充分摇匀，制成种子悬浮液。兜唇石斛和齿瓣石斛1 mL种子悬浮液平均种子数分别为42，125.6 粒。用移液枪吸取1 mL种子悬浮液，均匀播撒至培养盒中尼龙网布上，即每个培养盒中为2 mL种子悬浮液。兜唇石斛和齿瓣石斛种子各播种72个培养盒。
　　2.2 不同真菌接菌处理 取保存的FDaI7，FCb4，FDd1，3种菌株，于9 cm培养皿，采用土豆葡萄糖琼脂培养基（PDA），在（25±2） ℃ 黑暗条件下分别进行活化培养约1周，待菌丝长满培养皿，用灭菌解剖刀将长有菌丝的PDA培养基切成1 cm3的小块，作为接菌材料。将已播种兜唇石斛和齿瓣石斛种子的各72个培养盒随机分为4组，每组各18个培养盒，分别接种FDaI7，FCb4，FDd1的3种真菌菌块，另一组用空白PDA培养基作为对照。每个培养盒在2条尼龙网布之间的基质表面接入1～ 2块菌块。 (责任编辑：论文发表网)转贴于八度论文发表网: http://www.8dulw.com(论文网__代写代发论文_论文发表_毕业论文_免费论文范文网_论文格式_广东论文网_广州论文网)