铁皮石斛促生长内生真菌的筛选与鉴定

     铁皮石斛Dendrobium officinale是常用名贵中药材，具有益胃生津、滋阴清热等功效。由于石斛的自然繁殖率低，对环境条件要求较严格，产区药农长期采挖，自然资源已濒临灭绝。虽然石斛组织培养体系已成功建立，可大量繁殖石斛组培苗，但组培苗移栽成活率低，生长缓慢，成为石斛组培苗人工栽培的瓶颈。兰科植物与真菌能够形成典型共生关系，内生真菌或菌根真菌对兰科植物种子萌发、生长、成苗具有重要的促进作用。相同生境下的不同兰科植物有着相似的菌根真菌，而不同生境的同一兰科植物有不同的菌根真菌，两者间的共生关系是非专一性的^[1]。范黎等^[2]发现不同的真菌可促进同一种兰科植物的种子萌发，同一真菌也可与一种以上的兰科植物的种子形成共生关系。郭顺星等^[3]分离的2株内生真菌对铁皮石斛苗有促生长的活性。吴慧凤等^[4]也获得了9株对铁皮石斛有促生长作用的内生真菌。本试验探讨石斛属植物的内生真菌对铁皮石斛苗的作用，以期获得对石斛苗有促生长活性的内生真菌，为人工栽培石斛和组培苗移栽成活提供新的技术手段和理论基础。
　　1 材料
　　植物材料为铁皮石斛组培苗。内生真菌为分离自石斛属植物的36株内生真菌，由中国医学科学院药用植物研究所真菌室保存。
　　PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂12 g，水1 L；组培培养基：1/2MS（大量成分减半），马铃薯200 g，蔗糖30 g，活性炭2 g ，琼脂 7.5 g，水1 L，pH 5.8；共生培养基：1/2MS（大量成分减半），蔗糖 7.5 g，琼脂 7.5 g，水1 L，pH 5.8。
　　2 方法
　　2.1 内生真菌的培养
　　内生真菌接种于PDA培养基上，25 ℃黑暗培养10 d。
　　2.2 铁皮石斛组培苗的培养
　　将铁皮石斛组培苗继代于组培培养基上，在培养温度（昼/夜）25 ℃/18 ℃、光照周期12/12 h、光强2 000 lx的条件下培养，至铁皮石斛苗长到4～6叶期。
　　2.3 共生培养
　　取4～6叶期、生长一致的铁皮石斛组培苗接种至含有50 mL共生培养基的三角瓶中，每瓶接种1株，将1片直径6 mm菌片接种在距苗1 cm处，对照接种1片直径6 mm的PDA培养基。置于培养温度（昼/夜）25 ℃/18 ℃、光照周期12/12 h、光强2 000 lx的条件下培养45 d。
　　2.4 促进铁皮石斛苗生长的内生真菌的筛选
　　共生培养结束后，根据植株形态指标衡量内生真菌的作用，去掉病苗、死苗，统计成活苗的株高、茎粗、分蘖、生根等的形态指标筛选出有促生长活性的内生真菌。
　　2.5 内生真菌对铁皮石斛苗侵染的检测
　　共生的铁皮石斛苗根系以流水冲洗干净，切成0.5 cm小段，FAA溶液固定，石蜡包埋，切片，番红固绿对染，加拿大树胶封片，光学显微镜下观察。
　　2.6 促生长活性内生真菌的鉴定
　　2.6.1 形态鉴定 对产孢内生真菌的培养特性、显微形态特征进行观察，依据萨卡图（Saccardo）和休斯-塔巴基-巴伦（Hughes-Tabaki-Barron）真菌分类系统进行鉴定，分类检索参照文献[5-7]。
　　2.6.2 分子鉴定 对不产孢内生真菌依据rDNA 的内部转录间隔区（ITS）序列进行分子鉴定。内生真菌DNA提取采用CTAB法^[8]，用通用引物ITS1：（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′），ITS4：（ 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） [9]扩增ITS 1，5.8S和ITS2的全序列。PCR反应体系50 μL：1×PCR buffer，MgCl2 3 mmol·L^-1，4种dNTP各200 mmol·L^-1，上下游引物各0.3 μmol·L^-1，Taq酶2.0 U，DNA模板2 μL。反应程序：94 ℃预变性3 min，进入循环，94 ℃变性1 min，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃延伸8 min。PCR产物送上海生工测序。将不同真菌的ITS序列在GenBank中进行BLAST分析，寻找与查询序列相似性大于95%^[10]的rDNA ITS序列，利用ClustalX 1.83软件进行全序列比对^[11]，用Paup* 4b10软件^[12]进行聚类分析，构建最大邻接树。根据聚类结果，对内生真菌进行分子鉴定。
　　3 结果与分析
　　3.1 促进铁皮石斛生长的内生真菌

    　内生真菌与铁皮石斛共生培养后，有8个菌株具有促生长作用，其余28个菌株对铁皮石斛苗致病或致死，见图1。
　　铁皮石斛接菌苗的各个生长指标数据见表1，8个有促生长活性的菌株，对铁皮石斛苗的鲜重、茎粗、新根数量、最长根长度，新芽数量等均有不同程度的正向影响，而在株高、干重和最长芽长度3个方面没有显著影响。单因素方差分析表明，与对照相比，8个菌株均能够增加铁皮石斛苗的鲜重，其中05-R-5和34-S-9对铁皮石斛苗鲜重的影响达显著水平；分别比对照提高了84.4%，112.0%。8个菌株对铁皮石斛苗干重也有促进作用，但未达到显著水平。在茎直径方面，G03-R-5，05-R-5，22-R-4，38-S-11，34-S-9的促进作用都达到显著水平，分别比对照增加85.8%，85.8%，85.8%，143.3%，114.6%。在石斛苗新根数量上，G03-R-5，G08-R-17没有正向影响，另外6个菌株表现出了促进作用，其中22-R-4显著增加了石斛苗新根的数量，比对照高出120.1%。在最长根的长度方面，每个菌株也都有促进作用，05-R-5，38-S-11的促进作用显著，分别比对照增加107.8%，92.3%。对苗新芽数量的影响，22-R-4与对照水平相当，其他7个菌株具有促进作用，G03-R-5，35-R-11达显著水平，均比对照高150.0%。8个菌株对苗新芽生长的作用不明显，没有达到显著水平。
　　每一株真菌的接种，对铁皮石斛苗不同的生长指标的影响不同。G03-R-5对铁皮石斛苗的8个生长指标均有正向影响，对茎直径和新芽数量的影响达显著水平。35-R-11主要促进铁皮石斛苗的新芽数量；05-R-05主要促进铁皮石斛苗鲜重、茎直径和最长根的长度；22-R-4主要影响铁皮石斛苗的茎直径和新根的数量，具有促进生根的作用；38-S-11显著提高铁皮石斛苗的茎直径和最长根的长度；34-S-9主要提高铁皮石斛苗的鲜重和茎直径，G08-R-17显著提高铁皮石斛苗的新芽数量，具有促分蘖的作用。40-R-3对铁皮石斛苗除株高和最长芽长度外的6个生长指标均有促进作用，但并未达到显著水平。由此可见，单株真菌可以从不同的方面促进石斛苗的生长，对于铁皮石斛苗的每个生长指标，不同的菌株也表现出不同的促进作用。 (责任编辑：论文发表网)转贴于八度论文发表网: http://www.8dulw.com(论文网__代写代发论文_论文发表_毕业论文_免费论文范文网_论文格式_广东论文网_广州论文网)